什么是TauInteraction?
熒光顯微鏡是生命科學的重要研究工具之一，用于觀察細胞結構和功能。熒光顯微鏡的一個關鍵優勢在于能夠識別多個目標，并能夠觀察他們之間的相互作用。
分子相互作用為細胞提供能量，將基因組信息轉化為細胞的各種結構(Jacob F，Monod J.1961)。廣義地講，至少有三種類型的分子相互作用：核酸(DNA/RNA)-蛋白質、蛋白質-蛋白質和小分子-蛋白質(Zhang W et al. 2002, Schlessinger K et al. 2009, Yan L and Lamb RF 2011, Dunn JA et al. 2015, Pires BRB et al. 2018, Vidya MK et al. 2018)。
通過共振能量轉移(FRET，Förster 1960)實驗可以確認兩個分子之間發生相互作用。為了進行FRET實驗，被研究的分子中的一個被標記了充當“供體”的熒光探針，而另一個分子被標記了充當“受體”的探針。這樣的“供體-受體對”中供體的發射光譜和受體的激發光譜基本重疊。在這些條件下，如果兩個熒光團彼此足夠接近(小于10 nm，Valeur 2001)并且方向合適(Pietraszewska-Bogieland Gadella 2011)時，則可能發生FRET。距離和分子方向將決定發生了多少FRET；我們用FRET效率來衡量它，也是量化分子相互作用的廣泛的方法(Valeur 2001)。報告FRET發生狀態的另一個值是相互作用供體(f_D，fraction of interacting donor)的比例，它對應于在設定的時間內有多少分子參與分子相互作用(Valeur 2001)。本質上，來自供體熒光團激發態的能量通過以非輻射方式(不發射光子)轉移到受體熒光團。這一過程導致1)供體的熒光強度降低，2)受體的熒光強度增加，3)供體的熒光壽命縮短(Jares-Erijman and Jovin 2006)。這些來自于供體和受體不同的信息是獲取和分析FRET數據的一些策略的基礎。許多FRET方法依賴于基于強度的測量，例如供體猝滅、受體光漂白和敏化發射(Berney and Danuser 2003, Padilla-Parra and Tramier 2012, Algar WR et al. 2019)。基于強度的FRET簡化了儀器要求，但增加了實驗設計產生假象的風險(例如，供體-受體相對信號不平衡、通道間串色、供體光漂白、光致變性)或不太適合活細胞長時間觀察 (比如強光對樣品帶來的光毒性)。
為什么要使用TauInteraction？
FLIM（熒光壽命成像）-FRET方法仍然是FRET實驗的金標準，因為FRET讀數只取決于供體熒光壽命的變化，從而繞過了基于強度的方法面臨的大多數風險(Padilla-Parra and Tramier 2012, Algar WR et al. 2019)。然而，FLIM實驗的復雜性使得這種基于FLIM的FRET分析方法長期局限在擅長生物物理的一些科學家群體中被使用。
在基于熒光壽命的方法中，人們一直在努力尋找不需要復雜的物理模型，更直接的方法來探索FRET效率。這些無需擬合的方法主要側重于提供相關數據，以便更好地理解正在研究的生物系統(Leray et al. 2013)。遵循這一理念的供體分子的最小比例(mf_D，minimal fraction of donor molecules)是一個簡單但很有用的概念(Padilla-Parra S et al. 2008, 2011 and Leray et al. 2013)。mf_D的目的是評估參與FRET的最小分子數量。mf_D與相互作用供體的比例有關(f_D，Padilla-Parra S et al. 2008)。為此，mf_D使用在沒有受體的情況下來自供體分子的熒光壽命值參與計算(圖1A)。根據這一點，它根據測量到的熒光壽命變化計算出必須與該供體相互作用的最小分子數量。通過這種方法，mf_D特別適合于基于相互作用蛋白質的最小相對濃度實時地讀出分子間相互作用發生的程度。
 
圖一：TauInteraction原理圖. A) mf_D公式。詳情請見Padilla-Parra S et al. Biophys J. 2008. B) 圖示供體 (D, 綠色圓形) 和受體 (A, 紅色三角)。TauInteraction可以基于mf_D值描述相互作用的分子的百分比。
該如何使用TauSense來量化FRET
mf_D 概念非常適合于STELLARIS平臺，因為STELLARIS的TauSense工具可以直接獲取基于熒光壽命的信息（圖一及其參考文獻）。為了利用熒光壽命來定量讀出FRET狀態，我們實現了mf_D作為一個新的TauSense工具，稱為TauInteraction。TauInteraction的工作原理如下(圖一)：在FRET實驗中，可能有許多分子(供體和受體)非常接近，如果這些是隨機事件，發生FRET的平均分子數量可以忽略不計。相反，如果分子之間存在活躍的相互作用，它們保持緊密接近的時候將引起供體熒光壽命的降低。如果發生這種情況，TauInteraction會報告導致這種變化的分子比例。實驗結果是一張TauInteraction圖，其中包含在逐個像素級別上相互作用的分子的比例，圖片將實時(即在圖像采集期間)展現。此外，還提供了供體的熒光強度，如果需要，可以使用基于強度的FRET工具進行獨立分析。
作為TauInteraction如何將分子相互作用轉化為定量讀數的一個例子，我們首先用串聯結構來評估其表現，表達帶有短氨基酸序列的蛋白質的供體-受體熒光蛋白對(EGFP-mCherry)( Tramier M et al. 2006)。這種結構在瞬時轉染的活細胞中顯示出恒定的正FRET行為(見圖二)。有27%到29%的分子發生了互作。這與生物樣本中最大可觀察到的FRET是一致的(Padilla-Parra S et al.  2009)。如果我們有分離的供體和受體分子，相互作用的比例將低于這個最大值。如果我們降低受體分子的數量，我們就可以模擬這種情況。這很容易通過光漂白一些mCherry信號來實現。在光漂白一些受體并消除相互作用后，我們觀察到樣品中相互作用的分子的總比例下降了約50%(圖二)。
在STELLARIS上集成了基于熒光壽命的工具TauSense，比如TauInteraction，為研究人員以穩定和可量化的方式研究FRET過程鋪平了道路，最終目標是獲得生物相互作用的功能性數據。
 
圖二：活細胞中的TauInteraction。A)來自EGFP-mCherry串聯的強度圖像。B)在細胞上設置了三個感興趣區(ROI)，并在ROI1中使用高光強來漂白受體分子。圖中顯示了EGFP和mCherry的強度。TauInteraction圖像顯示了細胞中存在的相互作用分子的比例(以%值表示)，漂白區域的百分比明顯較低，這與受體分子的損失一致。
參考文獻 
1. Dunn JD, Alvarez LAJ, Zhang X, Soldati T.  Reactive oxygen species and mitochondria: A nexus of cellular homeostasis.  Redox Biol. 2015. PMID: 26432659 Free PMC article. Review. 
2. Förster, T. Transfer Mechanisms of Electronic Excitation Energy. (1960). Radiation Research Supplement 2. 
3. Jacob F and Monod J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.  J Mol Biol. 1961 Jun;3:318-56. doi: 10.1016/s0022-2836(61)80072-7. PMID: 13718526 No abstract available. 
4. Jares-Erijman EA, Jovin TM.  Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy.  Curr Opin Chem Biol. 2006 Oct;10(5):409-16. doi: 10.1016/j.cbpa.2006.08.021. Epub 2006 Sep 1. PMID: 16949332 Review.
5. Leray A, Padilla-Parra S, Roul J, Héliot L, Tramier M.  Spatio-Temporal Quantification of FRET in living cells by fast time-domain FLIM: a comparative study of non-fitting methods.  PLoS One. 2013 Jul 18;8(7):e69335. doi: 10.1371/journal.pone.0069335. Print 2013. PMID: 23874948 
6. Padilla-Parra S, Audugé N, Coppey-Moisan M, Tramier M.  Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.  Biophys J. 2008 Sep 15;95(6):2976-88. doi: 10.1529/biophysj.108.131276. Epub 2008 Jun 6. PMID: 18539634 
7. Padilla-Parra S, Audugé N, Lalucque H, Mevel JC, Coppey-Moisan M, Tramier M. Quantitative comparison of different fluorescent protein couples for fast FRET-FLIM acquisition. Biophys J. 2009 Oct 21;97(8):2368-76. doi: 10.1016/j.bpj.2009.07.044.
8. Padilla-Parra S, Auduge N, Coppey-Moisan M, Tramier M.  Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells.  Biophys Rev. 2011 Jun;3(2):63-70. doi: 10.1007/s12551-011-0047-6. Epub 2011 May 17. PMID: 28510004 
9. Padilla-Parra S, Tramier M.  FRET microscopy in the living cell: different approaches, strengths and weaknesses.  Bioessays. 2012 May;34(5):369-76. doi: 10.1002/bies.201100086. Epub 2012 Mar 13. PMID: 22415767 Review. 
10. Pietraszewska-Bogiel A, Gadella TW. FRET microscopy: from principle to routine technology in cell biology.  J Microsc. 2011 Feb;241(2):111-8. doi: 10.1111/j.1365-2818.2010.03437.x. Epub 2010 Sep 27. PMID: 21118231 Free article. Review. 
11. Pires BRB, Silva RCMC, Ferreira GM, Abdelhay E.  NF-kappaB: Two Sides of the Same Coin. Genes (Basel). 2018 Jan 9;9(1):24. doi: 10.3390/genes9010024.
12. Schlessinger K, Hall A, Tolwinski N.  Wnt signaling pathways meet Rho GTPases. Genes Dev. 2009 Feb 1;23(3):265-77. doi: 10.1101/gad.1760809.
13. Tramier M, Zahid M, Mevel JC, Masse MJ, Coppey-Moisan M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry pairs to donor photobleaching on FRET determination by fluorescence lifetime imaging microscopy in living cells. Microsc Res Tech. 2006 Nov;69(11):933-9. doi: 10.1002/jemt.20370.
14. Valeur, B. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. Methods vol. 8 (2001).
15. Vidya MK, Kumar VG, Sejian V, Bagath M, Krishnan G, Bhatta R.  Toll-like receptors: Significance, ligands, signaling pathways, and functions in mammals. Int Rev Immunol. 2018 Jan 2;37(1):20-36. doi: 10.1080/08830185.2017.1380200. Epub 2017 Oct 13. PMID: 29028369. Review.
16. Yan L, Lamb RF. Signalling by amino acid nutrients. Biochem Soc Trans. 2011 Apr;39(2):443-5. doi: 10.1042/BST0390443. PMID: 21428916. Review.
17. Zhang W, Liu HT.  MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 2002 Mar;12(1):9-18. doi: 10.1038/sj.cr.7290105.
 
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利用簡化FRET-FLIM方法直觀研究蛋白質相互作用
直播時間：北京時間2022年7月19日，22點
講者信息：
 
Dr. Sergi Padilla-Parra, Senior Lecturer, Randall Centre for Cell & Molecular Biophysics, King's College London
 
Dr. Julia Roberti, Product Manager, Leica Microsystems

 
 

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